На границата на фантастиката – създаден е изкуствен живот от „зомби клетки“: открит е начин за трансплантация на синтетична ДНК без отхвърляне

Създаването на синтетични организми е важна задача на съвременната биология. Технологията за изграждане на геном от нулата позволява създаването на микроорганизми с определени свойства, които могат да произвеждат редки медицински лекарства, да рециклират пластмаси или да синтезират екологично чисти горива. Проблемът с естествените защитни механизми на живите клетки обаче стои на пътя на масовото прилагане на тази технология.

Изследователи от Института „Крейг Вентър“ публикуваха научна статия, в която описват метод за заобикаляне на биологичните ограничения. Те доказаха, че за да се извърши успешна трансплантация на изкуствен генетичен код, клетката-реципиент трябва първо да бъде убита. Разработеният от тях протокол позволява въвеждането на синтетична ДНК в биологично неодушевена обвивка, след което клетъчните процеси се възстановяват и организмът започва да функционира единствено според новия код. Този подход решава проблем, който задържа развитието на индустрията повече от десетилетие.

Проблемът с хомоложната рекомбинация и фалшивите резултати

През 2010 г. Институтът „Крейг Вентър“ за първи път в историята успешно вмъкна напълно синтетичен геном в жива бактерия. Този процес беше наречен трансплантация на цял геном (Whole Genome Transplantation, или WGT). Същността на метода се състои в това, че ДНК, получена в лабораторията, се поставя в бактерията-реципиент, след което клетката започва да чете новата информация и да променя свойствата си.

Скоро обаче учените се сблъскват със сериозно ограничение. Методът WGT работел перфектно само в рамките на много тясна група бактерии – микоплазми (по-конкретно таксона Mycoides). Щом изследователите се опитали да приложат тази технология към други видове микроорганизми, експериментите завършили с неуспех. Причината за това е процес, известен в биологията като хомоложна рекомбинация.

Хомоложната рекомбинация е основен механизъм за поправка и обмен на генетичната информация, който присъства в повечето живи същества. Когато учените въвели гигантската молекула на синтетичната ДНК в жива бактерия от друг вид, клетката я приела като материал за взаимодействие.

За да проследят успеха на трансплантацията, учените винаги вкарвали в изкуствения геном ген за резистентност към определен антибиотик. След процедурата по трансплантация всички клетки били поставени в среда, съдържаща този антибиотик. Предполагало се е, че оригиналните клетки ще умрат и само тези, които успешно са приели новия синтетичен геном и са придобили резистентност, ще оцелеят.

Въпреки това, поради активността на ензимите за хомоложна рекомбинация, живите бактерии-реципиенти не са заменили целия си геном. Вместо това те просто изрязвали малък фрагмент, съдържащ гена за антибиотична резистентност, от плаващата в тях синтетична ДНК и го включвали в собствената си, оригинална хромозома. Останалата част от изкуствения геном е унищожена в процеса.

В резултат на това бактериалните колонии растат върху хранителната среда с антибиотика. Учените регистрирали положителен резултат, но при подробен анализ се оказало, че той е фалшиво положителен. Оцелелите колонии се състояли от стари бактерии-реципиенти, които само леко са модифицирали своята а, а не от нови организми, контролирани от напълно изкуствен код. Става ясно, че за да бъде трансплантацията успешна, трябва да се намери начин за пълно деактивиране на собствения геном на реципиента, преди той да реагира с новата ДНК.

Селективно химическо инактивиране на ДНК

Най-логичното решение е да се изключи оригиналната ДНК на клетката. Въпреки това стандартните методи за унищожаване на бактериите, като облъчване, интензивна топлина или излагане на корозивни киселини, не са били подходящи. Тези методи унищожават физически всички структури на клетката: клетъчната мембрана, рибозомите, протеините и ензимите. Ако този апарат бъде унищожен, клетката губи способността си да разчита всякаква ДНК, включително изкуствена ДНК. Трансплантацията би станала невъзможна.

Изследователите се нуждаеха от метод, който да засяга само генетичния материал, като оставя всички останали клетъчни компоненти непокътнати. Те се обърнаха към химикали, способни да образуват необратими връзки в молекулата на ДНК.

Основният инструмент в изследването е митомицин С (MMC) – химическо съединение, което принадлежи към класа на алкилиращите агенти. При навлизането си в клетката митомицин С селективно открива гуаниновите бази в ДНК и образува силни ковалентни връзки между тях. ДНК е двойна спирала, чиито нишки трябва да се разплетат по време на клетъчното делене или при разчитане на информацията. Митомицин С свързва тези две вериги. Поради тези химически кръстосани връзки механизмите за репликация се спират. Бактерията необратимо губи способността си да копира своя геном и да се дели. От биологична гледна точка тя става мъртва.

Учените провеждат серия от експерименти с бактериите Mycoplasma capricolum, за да открият идеалната доза. Оказало се, че при концентрация на митомицин С от 2,5 микрограма на милилитър и време на експозиция от два часа се постига желаният ефект. Геномът на самата бактерия е напълно обезсилен, но рибозомите, транскрипционните ензими и клетъчната мембрана запазват своята функционалност. Клетката е мъртва за делене, но машината ѝ за синтез на протеини е готова да започне работа.

За да потвърдят, че успехът се дължи на принципа на свързване на ДНК, а не на уникалните свойства на конкретен химикал, учените тестват друго вещество – псорален. Псораленът прониква между базовите двойки на ДНК, но се активира и създава кръстосани връзки само когато е изложен на ултравиолетово лъчение (UVA). Експериментът показа сходни резултати, което доказва, че контролираното инактивиране на ДНК е универсален подход.

Процесът на трансплантация без използване на антибиотици

След като получили решение с неживи бактерии Mycoplasma capricolum, изследователите пристъпили към етапа на въвеждане на синтетичния геном. Като донорен материал е използвана изкуствената хромозома JCVI-syn1.0. С помощта на химически реагенти (калциев хлорид и полиетиленгликол) клетъчните мембрани на бактериите са направени пропускливи, за да може масивната молекула ДНК да проникне вътре.

Тъй като собственият геном на реципиентите е бил унищожен от митомицин С, процесът на хомоложна рекомбинация не е могъл да започне физически. Обвивката приема донорската ДНК. Активните транскрипционни ензими, останали в клетката, започнали да взаимодействат с новия генетичен код. Те започват да синтезират нови матрични РНК, които след това се прехвърлят към рибозомите, за да произведат протеините, кодирани в синтетичната хромозома. Клетъчната активност беше напълно възстановена.

Най-важното постижение на този протокол е възможността за пълното избягване на антибиотиците при подбора на успешните транспланти. При класическия метод върху блюдата на Петри без антибиотици щеше да израсне солиден слой от стари бактерии, сред които щеше да е невъзможно да се открият няколко клетки с нов геном. При новия експеримент изследователите засяват резултатите върху нормална хранителна среда без добавяне на токсични вещества.

Тъй като всички първоначални клетки са били предварително убити с митомицин С, те не са могли да се делят и да образуват колонии. Единствените клетки, които показали растеж и деление върху хранителната среда, били тези бактерии, които успешно погълнали синтетичния геном JCVI-syn1.0.

За визуално потвърждение генът lacZ беше предварително инкорпориран в синтетичната хромозома. Бактериите, притежаващи този ген, при взаимодействие със специално вещество в хранителната среда се оцветяват в синьо. Всички колонии, които израснаха, се оказаха сини. Допълнителен лабораторен анализ с помощта на мултиплексна полимеразно-верижна реакция (PCR), при който се тестват единадесет специфични ДНК участъка, категорично потвърди, че отгледаните бактерии притежават единствено синтетичен геном. Не бяха открити следи от старата ДНК на Mycoplasma capricolum в активна форма.

Изследователите изчислиха ефективността на новия метод. При използване на живи реципиенти успешна трансплантация е имало в около един случай на 150 милиона клетки. Когато са използвани неживи клетки, общият брой на оцелелите микроорганизми е спаднал драстично, но относителната ефективност на въвеждането на нова ДНК се е увеличила. Една успешна трансплантация е извършена само за 288 жизнеспособни клетки. Това представлява повече от 500 000 пъти увеличение на ефективността на процедурата.

Значението за науката и биотехнологиите

Този експеримент ясно показва, че границата между жива и нежива клетка се определя не толкова от физическата цялост на организма, колкото от способността на генома да се възпроизвежда. Процесът на зареждане на живот не изисква напълно функционален реципиент. Минималното необходимо условие е наличието на непокътнат транскрипционен и транслационен апарат.

На практика този пробив премахва основна техническа пречка пред разширяването на методите на синтетичната биология. Премахването на проблема с хомоложната рекомбинация означава, че учените вече не трябва да се ограничават само до микоплазмите. Технологията проправя пътя за стандартизиране на процеса. В бъдеще изследователите ще могат да подготвят универсални клетъчни обвивки от различни бактериални видове, лишени от собствена генетична информация.

Тези подготвени празни клетки ще служат като основни платформи за въвеждане на всякакви компютърно разработени генетични последователности. Тази технология ще ускори създаването на специализирани микроорганизми за нуждите на медицината (например за синтез на сложни белтъчни съединения и нови антибиотици), биотехнологичната промишленост и опазването на околната среда, като ще направи възможно проектирането на живи системи със същата прецизност, с която инженерите сглобяват сложни технически устройства.